Rev. Fac. Agron. (LUZ) 1995, 12: 467~83

Determinación por HPLC de los azúcares en los frutos de guayaba (Psidium guajava L.) de una plantación comercial del Municipio Mara

HPLC determination of sugars in guava (Psidium guajava L.) fruits of a commercial plantation from Mara municipality

Lilia Arenas de Moreno² Merylín Marín³ Carmen Castro de Rincón⁴ Luis Sandoval⁵

Recibido el 22­03­94 . Aceptado el 28­03­95
1. Proyecto No. S1­2379 financiado por el CONDES y el CONICIT.

Resumen

Se estudió la variación del contenido de ribosa, xilosa, fructosa, glucosa, sacarosa y azúcares totales en frutos de guayaba provenientes de la Granja "Santa Ana", una plantación comercial ubicada en el Municipio Mara del Estado Zulia, Venezuela, cosechados en el trimestre Junio­Agosto (MES) de 1991, en diferentes estados de madurez (EM): Pintón, (P) Maduro (M) y Muy Maduros (MM). La determinación cualitativa y cuantitativa de los azúcares se realizó por cromatografia líquida de alta resolución utilizando una columna Alltech Carbohydrate 10 con acetonitrilo­agua (75:25) como fase móvil. El análisis estadístico se realizó utilizando un diseño completamente aleatorizado, con un arreglo factorial 3x3. Se realizó un análisis de varianza mediante el procedimiento General Linear Model del Statistical Analysis System ( SAS). Las comparaciones de medias entre tratamientos fueron realizadas por el Método de Tukey para los efectos principales, usando el método de los Mínimos Cuadrados para las interacciones significativas. Para la variable Xilosa, se encontró que no fue afectada por ninguno de los factores estudiados. Los resultados mostraron que las variaciones en el contenido de los diferentes azúcares dependen de MES pero no así el tipo de azúcar. La concentración de los diferentes azúcares también depende de EM. Se determinó que la fructosa es el carbohidrato más abundante en P. mientras que la sacarosa lo es en MM. La concentración de sacarosa aumenta con EM. La interacción MESXEM afectó todas las variables estudiadas excepto al contenido de xilosa. La ribosa varió de 0,0151 a 0,3300~o; la Xilosa de 0,0019 a 0,2146%; la fructosa de 1,7500 a 3,5370%; la glucosa de 1,3033 a 3,0449%; la sacarosa de 0,8181 a 4,2193% y azúcares totales de 4,1110 a 10,0097% en base fresca.

Palabras craves: Psidium guajava, frutas, azúcares, HPLC.

Abstract

Key words: Psidium guajava, guava, fruits. sugar. HPLC.

Introducción

La determinación individual de los azúcares más importantes en la guayaba, tales como glucosa, fructosa, sacarosa, sedoheptulosa, arabinosa, etc., se ha convertido en un estudio esencial, en la medida en que más investigaciones están siendo conducidas en las áreas de genética y en los mecanismos bioquímicos de la formación y degradación de los carbohidratos de este fruto. A esto se debe agregar el interés existente en el establecimiento o fijación de índices de maduración (23), así como la predicción del potencial de almacenamiento de los frutos basado en el contenido de azúcares bajo condiciones variadas (5,7,9,14,29,34,37).

Por otro lado, se debe considerar el hecho de que el análisis y la caracterización de los carbohidratos en los alimentos, tanto frescos como procesados, ha sido siempre un aspecto importante para los tecnólogos de alimentos, químicos, nutricionistas y la industria agro­alimentaria, los que buscan alternativas en cuanto a edulcorantes se refiere, para cubrir las demandas del mercado (10). Con el interés creciente de la nutrición, y consecuentemente, con el nivel nutricional, un control de calidad confiable se necesita para una amplia variedad de alimentos y aditivos alimentarios, particularmente en lo que se refiere al contenido de azúcares (16,39). Una posible relación entre el consumo de azúcares y algunos desordenes fisiológicos tales como caries dental, diabetes, obesidad, enfermedades coronarias, etc., ha sido establecida (25, 28).

La mayoría de las determinaciones tanto cualitativas como cuantitativas de los carbohidratos hen sido limitados a determinaciones de azúcares reductores totales y/o no reductores, cuyo método analítico está basado en la reducción de una solución alcalina de cobre por los azúcares reductores (15,22). Sin embargo, la utilización de la técnica HPLC (cromatografia líquida de alta resolución), ha permitido una rápida caracterización y cuantificación de muchos carbohidratos significativos tanto desde el punto de vista agronómico como nutricional (ó,9,10, 13,18,19,20,21,30,31,32).

Basados en lo anteriormente expuesto, el presente trabajo tiene como finalidad:

­ Caracterizar y cuantificar los carbohidratos presentes en frutos de guayaba de diferentes estados de madurez, y obtenidos­en épocas de cosecha distintas por HPLC.

­ Determinar las relaciones existentes entre la cantidad y tipos de azúcares, el estado de madurez de los frutos y la época de cosecha en que fueron colectados los mismos.

Materiales y métodos

1. Muestras de frutas

Las frutas fueron obtenidas de una de las plantaciones de guayaba más antiguas de la zona de Mara, ubicada en el sector Monte Verde y denominada Granja "Santa Ana", (MV), de donde se seleccionaron 10 plantas al azar de las 20 sometidas a estudio en el Proyecto denominado "Estudio preliminar sobre las características químicas de frutos de guayaba (Psidium guajava L.) en una plantación comercial del Municipio Mara del Estado Zulia (1). El criterio de selección de las plantas se basó en su productividad y la calidad fisicoquímica de los frutos.

Los muestreos se realizaron quincenalmente en el período comprendido entre Junio y Agosto de 1991. Las frutas colectadas de todos los lados de las plantas, en tres estados de madurez, Pintón (P), Maduro (M) y Muy Maduro (MM), fueron analizadas sobre la base de 50 frutas de pulpa roja seleccionadas al azar por cada estado de madurez. El estado de madurez se estableció tomando en cuenta el color de la corteza y su textura, la cual fue determinada utilizando un texturómetro, estableciéndose una escala de textura para cada estado de madurez:

Pintón (P): 0.56­1.05 kg/cm2 /cm²

Maduro (M): 0.14 ­ 0.49 kg/cm²

Muy Maduro (MM): < 0.11 kg/cm²

El análisis de los carbohidratos se realizó por triplicado para cada estado de madurez, utilizando muestras compuestas de 4­5 frutos (+ 500 g) cada una, y homogeneizadas en un procesador de alimento. La pasta así obtenida se conservó en bolsas plásticas de cierre hermético a ­15°C hasta su utilización.

2. Método de extracción

Duplicados de 10­20 gramos de pasta de guayaba fueron reflujados en 75 ml de una mezcla de metanol de alta pureza y agua en la proporción 80:20, a una temperatura de 80°C por una hora. Después de dejarlo enfriar, el extracto alcohólico fue filtrado al vacío a través de paper de filtro Whatman No. 1, y el material residual fue lavado con dos porciones de 15 ml de la mezcla alcohol­agua caliente (10,37).

El extracto alcohólico fue filtrado nuevamente utilizando un filtro de membrana de 0,45 ~m, y concentrado a una temperatura entre 40 y 60°C en un rotaevaporador Büchi. Una vez removido totalmente el alcohol, el extracto acuoso (7­10 ml), fue diluido en agua bidestilada a un volumen final de 50 ml.

Los extractos acuosos fueron nuevamente filtrados a través de un filtro de membrana de 0.2 ~m, y purificados con cartuchos SepPak C­18 (Waters Assoc., Inc. Milford, Massachusetts). Los dos primeros mililitros del filtrado fueron descartados y los siguientes fueron colectados para el análisis HPLC (25).

3. Análisis HPLC

Los extractos acuosos fueron analizados por HPLC, en un cromatógrafo de líquidos Shimadzu Corporation, Modelo LC­lOAD, equipado con: a) unidad degasificadora Modelo DGU­2A; b) distribuidor de solvente Modelo FCV­ 10AL; c) refractómetro diferencial Modelo RID­ 6A; d) horno para columna Modelo CIY)­ 10A; e) inyector tipo válvula de Reodine con un loop de 20111; y f) un integrador computarizado modelo C­R7A.

Una columna de acero inoxidable de 300mm x 4,1 mm D.I, (Alltech Carbohydrate 10 Il), conectada en serie a una precolumna (Alltech Adsorbosphere­NH2 5), fue utilizada para el análisis tanto cualitativo como cuantitativo (32).

La separación isocrática de los azúcares se realizó a una temperatura de 30°C, usando una fase móvil compuesta por 75% de acetonitrilo grado HPLC (Mallinckrodt) y 25% de agua bidestilada, previamente filtrada a través de un filtro de membrana de 0,45 gm y degasificada. (ó,18,20,30) Se empleó una velocidad de flujo de 0,8 ml/mint

La caracterización y cuantificación de los carbohidratos presentes en las muestras fue posible por la comparación de los tiempos de retención y las áreas de los picos de las muestras y los tiempos de retención y las áreas de los picos de soluciones de 10 mg/ml de patrones de ribosa, xilosa, fructose, glucose, sacarosa y lactose obtenidos de Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.). La reproducibilidad del método analítico se aseguró analizando cada muestra por triplicado. Los resultados se expresaron como porcentaje de peso fresco.

4. Análisis estadístico de los resultados

El experimento involucró un arreglo factorial de los tratamientos [tres estados de madurez (EM) x tres diferentes meses de cosecha (M)] con un diseño totalmente aleatorizado. Se realizaron análisis de varianza (ANADEVA) usando el procedimiento General Linear Model (GLM) del Statistical Analysis System (SAS.) Las comparaciones de medias entre tratamientos fueron determinadas por el Método de Tukey para los efectos principales, usando el método de los Mínimos Cuadrados para las interacciones significativas. Se usaron las transformaciones RAIZ CUBICA para las variables Ribosa y Xilosa, y ARCSEN de la raíz cuadrada para las variables Fructosa, Glucosa, Sacarosa y Azúcares totales.

Resultados y discusión

En esta investigación se identificaron seis tipos de azúcares: Ribosa, Xilosa, Fructosa, Glucosa, Sacarosa y Lactosa, ésta última sólo presente en trazas. Las figuras 1, 2 y 3 corresponden a los cromatogramas característicos de muestras de frutos de guayaba en los diferentes estados de madurez estudiados.

En los Cuadros 1 y 2 se muestran las variaciones de los contenidos de azúcares en las muestras de guayaba sometidas a estudio, por estado de madurez y por época de cosecha respectivamente.

A continuación se presenta la interpretación de los resultados obtenidos para cada variable en las muestras analizadas.

Ribosa

El contenido de ribosa varió de 0,0151 a 0,3300%. Los resultados demuestran que la mayor concentración promedio de este carbohidrato la presentaron los frutos cosechados en los meses de Junio y Agosto, no detectándose diferencias entre estos dos meses. Sin embargo, el análisis de varianza detectó que existen diferencias significativas (P<.05) al comparar las concentraciones de ribosa en los frutos cosechados en Julio, en donde se obtuvo la menor concentración. También se observó que no existen diferencias en el contenido de ribosa en los diferentes estados de madurez. La interacción (MXEM) muestra una diferencia significativa (P<.05), lo que indica que el contenido de ribosa varía entre los estados de madurez dependiendo del mes en que son cosechados los frutos (Figura 4). En todas las muestras analizadas se detectó la presencia de ribosa, la cual no ha si do previamente reportada como un constituyente de la guayaba. Los trabajos realizados por Chan y Kwok (11) y por Wilson et al (37) demostraron que fructosa, glucosa y sacarosa son los únicos azúcares presentes en frutos de guayaba. Sin embargo otras pentosas tales como arabinosa y xilosa han sido identificadas (28). La presencia de ribosa en las muestras analizadas, podría ser una consecuencia de la condición genética y/o ambiental que determine la variabilidad en las características químicas de los frutos de guayaba (17,33).

Fig. 1 Cromatograma característico de muestras de frutos de guayaba muy pintones

Fig. 3 Cromatograma característico de muestras de frutos de guayaba maduros

Fig. 3 Cromatograma característico de muestras de frutos de guayaba muy maduros

Fig. 4. Variación de la concentración de Ribosa en los frutos de guayaba

Cuadro 1. Rangos de variación de la concentración de azúcares en frutos de guayaba (Psidium guajava L.) provenientes de la Granja Monte Verde, colectados en tres estados de madurez

A.T.: Azúcares Totales
* azúcares expresados en g/100 g de muestra
NOTA: Información basada en 18 observaciones

Cuadro 2. Rangos de variación de la concentración de azúcares en frutos de guayaba (Psidium gunjava L.) provenientes de la granja Monte Verde, colectados en tres épocas

A.T.: Azúcares Totales
* azúcares expresados en g/100 g de muestra
NOTA: Información basada en 18 observaciones

Xilosa

La concentración de xilosa varió de 0,0019 a 0,2146~o, observándose su menor promedio en los frutos maduros y los cosechados en el mes de Julio, y el mayor en los frutos pintones y los cosechados en Junio y Agosto. E1 ANADEVA no detectó diferencias significativas para ninguno de los factores estudiados. La presencia de este carbohidrato como constituyente de la guayaba ha sido reportado por Nahar et al (28), quienes consideran que se debe a la existencia de polímeros no glucánicos en este fruto. Otros autores (35), consideran que la presencia de hongos pue d en pro du cir desdoblamiento de las pectinas, y trazas de xilosa o ácido galacturónico seen algunas veces detectados. La Figura 5 muestra las variaciones en la concentración de este carbohidrato dependiendo del estado de madurez y la época en que fueron cosechados.

Fructosa

Para esta variable, el ANADEVA detectó diferencias altamente significativas (P<.01) entre los diferentes meses de cosecha. En la Figura 6, puede observarse que el contenido de este carbohidrato es mayor en los frutos cosechados en el mes de Junio, disminuyendo drásticamente en los meses Julio y Agosto, no observándose diferencias entre estos dos últimos meses.

E1 análisis respecto al estado de madurez muestra que la menor concentración se obtiene en frutos maduros, diferenciándose significativamente (P<.05) del contenido de este carbohidrato en frutos pintones y muy maduros, y entre los que no existen diferencias. Estos resultados son diferentes a los reportados por Yusof y Mohamed (38), quienes reportan un incremento lineal de os niveles de fructose con la maduración del fruto de la variedad Vietnamita, y a los reportados por Wilson (36) quien citando a LeRiche, indica que la fructose es el azúcar más importante y que sus niveles se incrementan durante la maduración decreciendo en frutos sobremaduros.

E1 presente análisis también reveló diferencias significativas (P<.01) para la interacción (MXEM), indicando una clara dependencia entre estos dos factores. La Figura 6 muestra que las mayores concentraciones se obtuvieron en el mes de Junio en los diferentes estados de madurez. En Julio se observaron diferencias importantes entre el contenido de fructose en los frutos muy maduros con respecto a los frutos pintones y los maduros, mientras que en el mes de Agosto la mayor concentración se presentó en los frutos pintones sobre los maduros y los muy maduros. Las concentraciones de fructose variaron de 1.7500 a 3.5370%, niveles similares a los reportados por Chan y Kwok (11).

Fig. 5. Variación de la concentración de Xilosa en los frutos de guayaba

Fig. 6. Variación de la concentración de Fructosa en los frutos de guayaba

Glucosa

Con respecto a la glucose se observaron claras diferencias (P<.05) entre los meses en que fueron cosechados los frutos (Figura 7). Se determinó que en el mes de Junio su concentración es mayor que en los meses Julio yAgosto, no observándose diferencias significativas entre estos dos últimos. A1 analizar la relación entre los estados de madurez, se detectaron diferencias (P<.05) al observar las mayores concentraciones en los frutos pintones por encima de los frutos maduros, aún cuando no hay diferen ci as en rel ación a lo s frutos muy maduros, pudiendo observarse que su concentración tiende a disminuir en la medida en que avanza el estado de madurez de los frutos.

La interacción (MXEM) arrojó diferencias significativas (P<.05), observándose que las mayores concentraciones se obtuvieron en Junio, donde el contenido es similar para los tres estados de madurez, siendo ligeramente superior en los frutos pintones. En Julio (P<.01), la mayor concentración se observó en los frutos muy maduros, no existiendo diferencias entre los pintones y maduros. En Agosto, los frutos pintones mostraron el mayor contenido de glucose, no existiendo diferencias entre los maduros y muy maduros. Las concentraciones de este carbohidrato variaron de 1.3033 a 3.0449%, valores similares a los reportados por Nahar et al (28) y por Chan y Kwok (11), pero más altos que los encontrados por Wilson et al (37).

Sacarosa

Se observaron diferencias (P<.01) entre los diferentes meses de colección de los frutos, siendo Junio y Agosto los meses en donde los frutos presentaron las concentraciones más altas, en comparación con la del mes de Julio. Se observó que la sacarosa se presenta en los frutos muy maduros en mayores concentraciones, siendo los frutos pintones los que contienen la menor concentración. Estas diferencias son sig~uficativamente diferentes (P<.01) en todos los estados de madurez sometidos a estudio. El incremento en la concentración de sacarosa a medida que progresa la maduración del fruto se cree se debe al aumento en la actividad enzimática sobre las sustancias pécticas y la celulosa, que constituyen a su vez reserves de carbohidratos, y que sirven de fuentes potenciales de ácidos, azúcares y otras sustancias respiratorias durante el proceso de maduración (26,27,38). La interacción (MXEM) determinó que la concentración de sacarosa, en término generadas se trace menor en frutos cosechados en el mes de Julio, siendo su valor significativamente diferente (P<.05) de los valores encontrados en Junio y Agosto, los que son similares (Figura 8). En los tres meses, las concentraciones más altas las mostraron los frutos muy maduros, seguido de los maduros y los pintones. Su concentración varió de 0.8181 a 4,2193%, valores similares a los reportados por Abreu de V. (1,2), Arenas de M. (4), y Marín, et al (24). Partiendo de los resultados obtenidos, en donde los niveles de sacarosa aumentan con el estado de madurez de los frutos, podría considerarse como una medida cuantitativa del índice de maduración de los frutos de guayaba.

Fig. 7. Variación de la concentración de Glucosa en los frutos de guayaba

Fig. 8 Variación de la concentración de Sacarosa en los frutos de guayaba

Azúcares Totales

A1 analizar el contenido de Azúcares Totales (AT), se pudo observer que los frutos muy maduros son los que contienen la mayor concentración, siendo ésta significativamente diferente (P<.01) de los otros dos estados de madurez considerados, situación contraria a la que reporta Chyau et al ( 14). También se observó que la mayor concentración de AT se obtuvo en los frutos cosechados en el mes de Junio y la menor en los frutos del mes de Julio, siendo significativas las diferencias (P<.01) entre los tres meses considerados (Figura 9). La interacción (MXEM) mostró diferencias significativas (P<.05). Nuevamente los frutos muy maduros fueron los que presentaron las concentraciones más altas en los diferentes meses de cosecha, con respecto a los pintones y maduros, aunque no existen diferencia entre estos últimos. E1 contenido de azúcares totales varió de 4.1110 a 10.0097%, rangos similares a los reportados por otros autores (2,3,8,12,24,36).

Fig. 9. Variación de la concentración de Azúcares Totales en los frutos de guayaba

1. Las variaciones en el contenido de azúcares en las muestras de guayaba analizadas dependen del momento en que son cosechados los frutos durante el pico de producción en la zona de Mara.

2. Los análisis de varianza demostraron que el contenido de cada uno de los azúcares identificados varían significativamente dependiendo del estado de madurez de los frutos.

3. A1 analizar el comportamiento de los frutos en los diferentes estados de madurez a lo largo del período de cosecha, se observaron cambios significativos durante el mes de Julio, mes en el cual la producción de guayaba en la zone de Mara alcanza su mayor nivel.

4. Se determinó que la fructosa es el azúcar más abundante en los frutos pintones (P), seguido por la glucosa, mientras que en los frutos muy maduros (MM), es la sacarosa el azúcar predominante.

5. Este estudio demostró que la sacarosa aumenta con el estado de madurez de los frutos, lo que permitiría utilizarla como posible índice de maduración.

6. Todos los azúcares estudiados fueron detectados en la totalidad de las muestras analizadas, lo que permite afirmar que el tipo de carbohidrato no depende de ninguno de los factores analizados en este estudio.

7. La identificación de ribosa como constituyente en la guayaba de la zona de Mara supone la influencia de la variabilidad genética. Sin embargo, se debe profundizar en el análisis de esta variable para proporcionar resultados concluyentes.

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