Rev. Fac. Agron. (LUZ). 1998, 15: 87-106
Procesos implicados en la digestión microbiana de los forrajes de baja
calidad
Factors involved in microbial digestion of low-quality forages
Recibido el 08-07-1997l Aceptado el
10-12-1997
1. Departamento de Producción Animal y Ciencia de los Alimentos, Universidad de Zaragoza.
M. Servet 177, 50013 Zaragoza, España. Fax: 976-761612. e-mail: mfonde@posta.unizar.es
Manuel Fondevila1
Resumen
En este artículo se revisan los mecanismos de unión y actividad
enzimática contra los polisacáridos de la pared celular de los forrajes en el rumen, los
organismos envueltos en la degradación y las restricciones físicas, químicas y
ambientales que afectan al proceso. La adhesión microbiana a las partículas de es un
paso esencial en la digestión de los polisacáridos de la pared celular. La adhesión
específica de las bacterias envueltas es mediada por tres estructuras: glicocalix,
celulosomas y dominios de unión celulásica, dichos mecanismos y su importancia son
discutidos. La degradación de la celulosa, hemicelulosa o pectina es llevada a cabo por
diferentes complejos enzimáticos, donde varias enzimas actúan específicamente a los
enlaces entre las unidades de carbohidratos. La habilidad de los organismos para digerir
la pared celular depende de la forma, diversidad y modo de acción de estas enzimas. Los
microorganismos de los tres grupos principales presentes en el rumen son capaces de
degradar polisacáridos estructurales, pero la importancia de los géneros envueltos y
especies de protozoarios, hongos o bacterias en la digestión total de la pared celular de
los forrajes depende de tres tipos de factores: ecológicos, como su abundancia en el
rumen o su relación con otras especies microbianas; factores relacionados al sustrato,
como la estructura anatómica y composición química de los forrajes; y las condiciones
ambientales para la fermentación. Excepto para interacciones microbianas, que serán
tratadas en otra parte, los restantes puntos serán discutidos.
Palabras claves: digestión microbiana, adhesión, estructura del forraje,
condiciones ambientales.
Abstract
This paper reviews the mechanisms of microbial attachment to and
enzymatic activity against forage cell wall polysaccharides in the rumen, the organisms
involved in degradation and the physical, chemical and environmental constraints that
affect the process. Microbial adhesion to forage particles is an essential step in
digestion of cell wall polysaccharides. Specific adhesion of the bacteria involved is
mediated by three structures: glicocalix, cellulosomes and cellulase binding domains,
whose mechanisms and importance are discussed. Degradation of cellulose, hemicellulose or
pectin is carried out by different enzymatic complexes, where various enzymes attack
specifically the bonds among the carbohydrate units. The ability of organisms to digest
cell wall depends on the kind, diversity and mode of action of these enzymes.
Microorganisms of the three main groups present in the rumen are capable of degrading
structural polysaccharides, but the importance of the involved genus and species of
protozoa, fungi or bacteria in the overall digestion of forage cell wall depends on three
types of factors: ecological, such as their abundance in the rumen or their relationship
with other microbial species; substrate-related factors, like the anatomic structure and
chemical composition of forages; and the environmental conditions for fermentation. Except
for microbial interactions, which will be treated elsewhere, the remaining points are
discussed.
Key words: microbial digestion, adhesion, forage structure, environmental
conditions.
Introducción
El principal interés productivo del ganado rumiante reside en su
capacidad de aprovechar como nutrientes los productos de la digestión microbiana de la
pared celular vegetal, que tiene lugar fundamentalmente en el rumen. Desde este punto de
vista, la explotación de recursos lignocelulósicos de baja calidad, por su relativa
abundancia y bajo costo económico, tiene especial trascendencia en sistemas extensivos y
semi-intensivos de producción, especialmente en regiones con escasa disponibilidad de
otras fuentes de alimento para el ganado. El conocimiento de los mecanismos implicados en
la acción de la población ruminal sobre los forrajes es fundamental para la
optimización de la utilización de éstos.
Dos son las etapas en que se lleva a cabo la digestión microbiana de
los polisacáridos estructurales en el rumen: en primer lugar, la colonización de los
substratos que llegan al rumen y la adhesión íntima de los microorganismos a estas
estructuras vegetales; en segundo lugar, la acción enzimática sobre dichos substratos,
independientemente de la posible utilización de los productos resultantes. La magnitud de
estos procesos está mediatizada por la naturaleza de la pared celular vegetal, por las
características de la población microbiana implicada en dichos procesos, y por las
condiciones del ambiente ruminal para favorecer o limitar estos procesos.
La adhesión como proceso previo a la digestión de polisacáridos
estructurales. Los microorganismos ruminales son clasificados por Czerkawski y Cheng
(19) en tres subpoblaciones, atendiendo a su interacción con las partículas de alimento:
1) los vehiculados con el fluido ruminal; 2) los débilmente asociados con las
partículas; y 3) los firmemente adheridos a dichas partículas. Dentro del primer grupo
se encuentran los microorganismos que utilizan los nutrientes solubles del líquido
ruminal, además de los que se van desprendiendo de las partículas de alimento. Como
organismos libres, tienen escaso papel en la digestión de las partículas sólidas, pero
muchos de ellos poseen capacidad de adhesión, y son los que de hecho inician el proceso
de colonización de nuevas partículas.
Los dos grupos restantes suponen entre el 70 y el 80% de la población
ruminal (31). Los organismos débilmente adheridos pueden ser desprendidos por lavado de
las partículas, y se adhieren generalmente por mecanismos inespecíficos que implican
atracciones fisicoquímicas (60), o interaccionan con otros microorganismos adheridos a
las partículas (66).
La adhesión íntima al substrato permite una mayor eficiencia de
hidrólisis enzimática y una mayor disponibilidad de los productos de la digestión de la
pared, además de proteger de la predación de otras especies y de aumentar el tiempo de
retención en el rumen (17, 26). La importancia de la adhesión de las bacterias
celulolíticas a la pared celular para la degradación de ésta ha sido puesta de
manifiesto en diversos trabajos (47, 55), y Cheng y col. (16) llegan a considerarlo como
requisito indispensable. Especies bacterianas sin capacidad adherente, o cepas no
adherentes de las especies celulolíticas tienen una trascendencia mínima en la
digestión de los polisacáridos de la pared celular (53, 55). La adhesión puede estar
sujeta a adaptación (51), como muestra la pérdida de la capacidad adherente a celulosa
de Fibrobacter succinogenes tras cultivos sucesivos en un medio con celobiosa como
único substrato (62).
El conocimiento de los mecanismos celulares de adhesión de los
protozoos y hongos ruminales es escaso (51). Las estructuras específicas implicadas en la
adhesión bacteriana han sido revisadas por Pell y Schofield (60), que las resumen en 3:
glicocálix, celulosomas y sectores de enlace de enzimas celulolíticas. Estos últimos
serán comentados en el Apartado 3. La cápsula glicoproteica externa que envuelve a las
bacterias celulolíticas principales (F. succinogenes, Ruminococcus albus y R.
flavefaciens) es denominada glicocálix, y ha sido puesta en evidencia
fundamentalmente a partir de estudios de microscopía electrónica (49, 65). Los
glico-cálices de ambas especies de Ruminococcus son más gruesos que el de F.
succinogenes, por lo que su adhesión es menos sensible a la incidencia de factores
ambientales que la de este último (62), como se desprende del cuadro 1. En F.
succinogenes, diversas proteínas, junto con algunos lípidos, de la superficie
celular, deben estar implicadas en los procesos de adhesión (33)
Los celulosomas son estructuras extracelulares identificadas empleando
cultivos de Clostridium thermocellum no ruminal, como modelo (48). Son complejos
polipeptídicos esféricos que incluyen un paquete enzimático con actividad celulasa,
agrupando las enzimas entre sí por la acción de un polipéptido sin actividad
hidrolítica, que además está implicado en la adhesión del celulosoma al substrato (10,
50). Los celulosomas, al favorecer el contacto íntimo de la bacteria y de sus enzimas con
las partículas vegetales, aumentan la magnitud de la acción enzimática sobre éstas.
Aunque se ha constatado la presencia de celulosomas en las especies celulolíticas
ruminales (42), se desconoce si su función y modo de acción es similar a la de los de Cl.
thermocellum .
Actividad enzimática frente a polisacáridos estructurales. Este
tema ha sido objeto recientemente de numerosas revisiones (25, 26, 70). Las enzimas
implicadas en los diversos procesos de degradación de celulosa y hemicelulosas de la
pared celular vegetal (figura 1) parecen estar muy distribuidas entre las especies
celulolíticas de microorganismos ruminales. Como ejemplo, F. succinogenes , uno de
los organismos más estudiados, produce al menos 8 glucanasas diferentes, una
celodextrinasa, una celobiosidasa y una celobiasa, además de una endoxilanasa, una
?-glucuronidasa, varias esterasas y una arabinofuranosidasa (26). Los hongos ruminales
también producen un complejo enzimático celulasa muy activo frente a celulosa
cristalina, además de xilanasas muy activas y altos niveles de ferúlico y cumárico
esterasas (15). El protozoo Polyplastron multivesiculatum produce una endoglucanasa
y una ß- glucosidasa (13).
Las enzimas de F. succinogenes son muy activas frente a celulosa
cristalina, pero esta acción es mínima en extractos libres de células. Por contra, las
celulasas de R. flavefaciens mantienen su actividad en ausencia de las células
productoras (25).
Se ha observado que algunos de los complejos enzimáticos
celulolíticos de los organismos ruminales poseen, además de su parte catalítica,
responsable de la actividad hidrolítica per se, una parte responsable de la
adhesión de la enzima al substrato (32, 52), que aumenta por ello la eficiencia de la
acción enzimática. Considerando la localización superficial de las enzimas
celulolíticas en las bacterias ruminales, estos sectores de enlace de las enzimas (cellulose
binding domains) contribuyen también a la adhesión microbiana al substrato.
En la práctica, la especificidad de acción de estas enzimas no es
tanta como lo que sugieren sus nombres. De hecho, es el tipo de enlace sobre el que
actúan lo que determina su especificidad, pudiendo atacar un mismo tipo de enzima tanto
las cadenas de celulosa como de xilano. La gran diversidad de enzimas que se aprecia en la
figura 1 se justifica teniendo en cuenta la variabilidad y complejidad de la estructura
química de la pared celular vegetal (ver apartados posteriores). Por otra parte, es
curioso que cada microorganismo, en lugar de una sola, produce varias enzimas que actúan
de forma muy similar.
Se asume que el proceso de digestión enzimática de la celulosa en el
rumen sigue el modelo observado en los hongos aerobios. Este proceso se inicia con el
ataque de endo-1,4 ß glucanasas (celobiohidrolasas) a las regiones más amorfas de la
celulosa, rompiendo aleatoriamente las cadenas en celodextrinas y creando así extremos
libres para la acción de exo-1,4 ß glucanasas, que liberan unidades de celobiosa a
partir del extremo de la cadena. Estas celobiosas son finalmente hidrolizadas a glucosa
por ß-glucosidasas. Las xilanasas están más ampliamente distribuidas entre las
bacterias ruminales que las celulasas, aunque hay que tener en cuenta la mayor diversidad
de las enzimas implicadas en la hidrólisis de las hemicelulosas, debida a la propia
variabilidad en la composición de este polisacárido.
Cuadro 1. Efecto de diversos factores ambientales sobre la adhesión
de las principales bacterias celulolíticas (60).
Tratamiento |
R. albus |
F. succinogenes |
R. flavefaciens |
Oxígeno |
« |
¯ 80 % |
« |
Temperatura |
4 ºC ¯100 % |
4 ºC ¯100 % |
4 ºC ¯100 % |
|
38 ºC « |
38 ºC « |
38 ºC « |
pH |
4,5 - 5 ¯; 5,5 - 8 « |
5,3 - 6,8 « |
4 ¯55 % ; 6 «; |
|
|
|
8 ¯ 40 % |
Glucosa |
1 % |
|
0,01 M «; 0,18 % « |
Celobiosa |
1 % ¯ 8 % ; 1 % |
1 % ¯ 73 % |
1 % ¯ 24 %; 0,34 % « |
Amilopectina |
0,25 % ¯ 70 % |
0,25 % ¯ 43 % |
0,25 % ¯ 68 % |
Cationes |
Ca++ ¯; « |
Ca++ y Mg++« |
Ca++ y Mg++ |
Metilcelulosa |
0,05 % ¯ 97 %; |
0,05 % ¯ 90 %; |
|
|
0,1 % ¯ 30 % |
0,1 % ¯ 70-80 %; ¯30% |
0,1 % ¯ 100 % ;¯ 30 % |
Proteasa |
¯ |
¯ |
|
(a) exo- 1, 4- ß glucanasa (celobiohidrolasa). (b) endo- 1,4- ß
glucanasa. (c) celodextrinasa. (d) 1,4- ß glucosidasa (celobiasa). (e) endo- 1, 4- ß
xilanasa. (f) ??-L- arabinofuranosidasa. (g) acetil - xilan esterasa. (h) ácido ferúlico
esterasa. (i) - glucuronidasa. (j) 1,4- ß xilosidasa.
Figura 1. Acción enzimática sobre celulosas y hemicelulosas
(fuente: Flint, 1994). Glu: glucosa ; Xil: xilosa ; Ara: arabinofuranosa ; Ac: grupo
acetilo; Fer: ácido ferúlico ; me Glc: ácido 4-O- metil glucurónico.
Organismos implicados en la digestión de la pared celular vegetal
Protozoos. El efecto de los protozoos sobre la digestión de la
fibra vegetal depende del papel y de la importancia relativa de los distintos géneros y
especies en el ecosistema ruminal (45, 71). En general, la presencia de protozoos aumenta,
directa o indirectamente, la digestión ruminal de celulosa y hemicelulosas respecto a
animales defaunados. Aunque las actividades enzimáticas endoglucanasa, ß-celobiosidasa y
ß-glucosidasa implicadas en la hidrólisis de celulosa por una parte, y
hemicelulasa y xilanasa, por otra, están ampliamente distribuidas entre los protozoos del
rumen (72), se continúa especulando si su acción puede ser debida, al menos en parte, a
las bacterias que contienen (20).
A partir de estudios con protozoos cultivados in vitro, tratados
con antibióticos para eliminar la posible contaminación bacteriana (cuadro 2), se ha
observado que la celulosa cristalina (avicel) es degradada en un 30% por protozoos de los
géneros Eudiplodinium y Polyplastron, y en un 10% por Epidinium (45). La capacidad de degradar celulosas sustituidas (hexaetilcelulosa,
carboximetilcelulosa) es mayor para todos los géneros, siendo más limitada en Entodinium e Isotricha. Sin embargo, el crecimiento en medios que incluyen polisacáridos
estructurales como única fuente de energía respecto a un medio sin substrato (cuadro 3)
es muy variable, y sólo Eudiplodinium y Epidinium responden positivamente a
la incorporación de una fuente de celulosa o de xilano.
Entre los Ophryoscolecidos, los protozoos de los géneros Eudiplodinium,
Polyplastron y Epidinium son activos degradadores de xilano, utilizándolo como
fuente de nutrientes, y degradan celulosas sustituidas con bajo grado de cristalinidad,
aunque no son capaces de utilizar los productos de su hidrólisis. Sólo los dos primeros
géneros mencionados son capaces de digerir y utilizar celulosa cristalina. Los protozoos
del género Entodinium no son capaces de actuar frente a este tipo de substratos,
mientras que los protozoos del género Isotricha tienen cierta actividad ß-
glucanasa, pero no utilizan los productos de la hidrólisis para su crecimiento (45, 72).
La capacidad de depolimerizar pectina está presente en algunas especies de protozoos,
pero la posibilidad de utilizar los productos liberados como fuente de energía es mínima
(59).
Cuadro 2. Degradación (%) de sustratos celulósicos (HEC,
hexaetil-celulosa; CMC, carboximetilcelulosa) por cultivos puros de protozoos (24 h; 45)
|
Avicel |
HEC |
CMC |
Eudiplodinium |
24,9 ± 7,8 |
62,0 ± 3,8 |
62,8 ± 0,7 |
Polyplastron |
30,6 ± 2,9 |
55,2 ± 5,5 |
60,3 ± 1,3 |
Epidinium |
10,0 ± 2,7 |
62,3 ± 0,9 |
63,7 ± 2,6 |
Entodinium |
trazas |
28,7 ± 1,7 |
22,7 ± 1,1 |
Isotricha |
5,4 ±1,7 |
54,1 ± 0,8 |
42,3 ± 3,9 |
La capacidad de los protozoos de adherirse a las partículas de pared
celular es reducida, excepto en el caso de los holótricos, estimulados probablemente por
quimiotactismo hacia azúcares solubles (9, 59), aunque su actividad fibrolítica es
escasa. Los Epidinium se adhieren a las partículas por una zona situada en su
parte anterior; luego, vierten enzimas extracelulares que van rompiendo los tejidos
vegetales en pequeños fragmentos que son entonces ingeridos y digeridos intracelularmente
(9). Los grandes entodiniomorfos únicamente tienen actividad enzimática intracelular, y
por ello ejercen su acción degradativa ingiriendo partículas suspendidas en el medio,
que luego digieren intracelularmente (12).
Hongos. La población de hongos anaerobios del rumen está
directamente relacionada con el contenido en fibra de la dieta, y su proporción disminuye
en dietas ricas en almidón o azúcares solubles (34). Los hongos ruminales tienen
capacidad enzimática de hidrolizar celulosa y xilano, aunque parece que no pectina (29,
39). Lógicamente, su actividad enzimática frente a estos substratos es variable
dependiendo de su origen filogenético, en especial de su estructura rizoidal, pero se ha
postulado que algunas especies, como Neocallimastix frontalis, Piromyces comunis y Orpinomyces
joyonii son tanto o incluso más eficientes en la digestión de los polisacáridos
estructurales como las especies bacterianas más activamente celulolíticas (11, 14).
La acción fúngica sobre la pared celular vegetal (cuadro 4) y su
contribución a la digestión ruminal de ésta, parece estar muy relacionada con su activa
colonización. Se ha observado mediante microscopía electrónica que las zoosporas son
atraídas por quimiotactismo (9), y se adhieren rápidamente a las partículas,
preferentemente en estomas y zonas de corte de los tejidos lignificados (esclerénquima,
xilema), aunque los tejidos vegetales no lignificados (floema, parénquima medular) son
los más rápidamente degradados (2, 34). En este sentido, los hongos ruminales son
especialmente activos frente a substratos muy lignificados (44). De hecho, aunque no está
probada su capacidad de utilización de lignina como fuente de nutrientes, N. frontalis puede solubilizar pequeñas cantidades de lignina de la pared celular vegetal (2, 39),
probablemente debido a la solubilización de compuestos fenólicos, en mayor medida que
las bacterias (14), aumentando la accesibilidad de los polisacáridos estructurales para
las bacterias. Los hongos ruminales, a diferencia de algunas bacterias, no son capaces de
fermentar los compuestos fenólicos (3). Por otra parte, la acción mecánica de los
hongos sobre la pared celular vegetal disminuye la rigidez estructural de los forrajes
(14), y favorece la ruptura de las partículas de forraje (59), aumentando también así
la superficie accesible para la acción bacteriana.
Cuadro 3. Proporción (% respecto al inicio del cultivo) de
protozoos vivos respecto a un medio control sin sustrato tras 24 h de cultivo (45).
|
Control |
Almidón |
Avicel |
Xilano |
CMC |
Eudiplodinium |
< 5 |
401 |
147 |
200 |
< 5 |
Polyplastron |
34 |
85 |
58 |
60 |
15 |
Epidinium |
6 |
12 |
9 |
100 |
< 5 |
Entodinium |
< 5 |
< 5 |
< 5 |
< 5 |
< 5 |
Isotricha |
95 |
181 |
89 |
77 |
103 |
Cuantitativamente, la magnitud de la contribución de los hongos a la
digestión de la pared celular in vivo no esta totalmente esclarecida. Fonty y col.
(30) observan que la presencia de hongos en el rumen no tiene un gran efecto sobre la
desaparición de materia seca o la concentración de ácidos grasos volátiles, a pesar de
que la actividad glucosidasa y polisacaridasa de la población microbiana adherida a las
partículas aumenta apreciablemente.
Bacterias. A pesar del papel de las poblaciones protozoaria y
fúngica del rumen en la digestión de la pared celular vegetal, parece claro que son las
bacterias los microorganismos más activamente implicados en este proceso, tanto
cualitativamente, por su alta actividad enzimática, como a nivel cuantitativo, por la
magnitud de su repercusión debida a su elevada concentración en el rumen.
Las tres especies bacterianas celulolíticas predominantes, Fibrobacter
succinogenes, Ruminococcus flavefaciens y R. albus, tienen características
peculiares que las diferencian de otras especies que pueden estar también implicadas en
el proceso de digestión de la pared celular vegetal. Algunas, como Butyrivibrio
fibrisolvens, Clostridium locheadii, Cl. longisporum o Eubacterium
cellulosolvens pueden considerarse tambien celulolíticas, pero su importancia en la
digestión de la pared celular es secundaria, en el caso de las tres últimas, por su
escasa concentración en el rumen (20). Tanto B. fibrisolvens (4) como Cl.
longisporum (68) carecen de estructuras de adhesión de tipo celulosoma, limitándose
en gran medida su capacidad de digestión del substrato. Además, es necesario considerar
otras especies no celulolíticas que utilizan productos resultantes de la hidrólisis de
las paredes vegetales, que pueden contribuir a evitar efectos de retroinhibición
enzimática por acúmulo de catabolitos en el medio y a su vez aportar nutrientes
esenciales (amoníaco, ácidos grasos ramificados) a las bacterias más activamente
implicadas.
Cuadro 4. Degradación (% desaparición de materia seca) de diversos
sustratos vegetales por distintas especies fúngicas tras 6 días de incubación in
vitro (fuente: Fonty y Gouet, 1993).
|
Paja de trigo |
Raygras |
Cañote de maíz |
Neocallimastix frontalis MCH3 |
35,1 |
30,0 |
59,8 |
Piromyces comunis FL |
26,5 |
37,5 |
60,0 |
Orpinomyces joyonii NJ1 |
33,5 |
35,2 |
58,7 |
Caecomyces comunis FG10 |
4,8 |
11,0 |
58,0 |
Las bacterias celulolíticas se caracterizan por su alta
especialización nutritiva. Como muestra el cuadro 5 (69), la mayoría de las especies
bacterianas que fermentan carbohidratos pueden utilizar una gran variedad de
monosacáridos y disacáridos como nutrientes, incluyendo aquellos derivados de la
fermentación de polisacáridos estructurales. Sin embargo, las bacterias celulolíticas
únicamente utilizan celulosa y sus productos como nutrientes, por lo que se ven obligadas
a especializarse en la hidrólisis de dicho polímero y de sus productos (celodextrinas),
en un ambiente líquido que favorece la competencia entre gran variedad de
microorganismos, y dada la complejidad química y estructural de los forrajes. Para
conseguirlo, las bacterias deben sintetizar grandes cantidades de enzimas, muy variadas
para garantizar su acción frente a una amplia gama de substratos, que hidrolicen la
celulosa y las hemicelulosas relativamente rápido (ver apartado 3). Además, estas
celulasas se localizan primordialmente en la superficie de las bacterias (54, 67) para
favorecer el contacto físico con el substrato. En el mismo sentido, las bacterias
celulolíticas desarrollan diversos mecanismos muy especializados de adherencia íntima a
estos substratos, que evitan la degradación de las celulasas por las proteasas ruminales,
protegen de la acción predatoria de los protozoos y evitan la salida del rumen, además
de favorecer la captación preferente de los productos de la hidrólisis respecto a otras
especies.
Los múltiples trabajos que han comparado las especies bacterianas en
cuanto a su capacidad de degradar substratos fibrosos han obtenido resultados dispares,
debido básicamente a la propia variedad de éstos substratos y de las cepas bacterianas
empleadas (cuadro 6; 20). Las tres especies celulolíticas principales tienen
depolimerasas con capacidad de romper las cadenas de hemicelulosas y, en menor medida, de
pectina, de los forrajes, dada la especificidad de las glucanasas por el tipo de enlace,
aunque no son capaces de utilizar F. succinogenes
los productos resultantes de la
hidrólisis (22, 27). Algunas de las especies no celulolíticas más abundantes en el
rumen, como B. fibrisolvens o P. ruminicola, son capaces de hidrolizar estos
polisacáridos, en menor medida que las anteriores, y pueden utilizar las pentosas y
ácidos urónicos resultantes (20).
Factores que inciden en los procesos de digestión microbiana de los
forrajes
Composición y estructura de la pared celular vegetal. Los
forrajes, tanto los tropicales como los de clima templado, difieren entre sí en la
estructura y composición de su pared celular, dependiendo de su especie vegetal, parte
anatómica y fase de desarrollo (38). En el mismo sentido, la estructura de la pared
celular vegetal es muy compleja y variable, tanto química como histológicamente. Todas
estas diferencias condicionan el modo de ataque microbiano a los polisacáridos
estructurales, y en último término, el ritmo y extensión de la degradación por los
microorganismos ruminales. De hecho, el ritmo de digestión de la celulosa de los forrajes
por la población ruminal es muy inferior a la observada in vitro sobre celulosa
purificada (69).
Mientras el floema y el mesófilo de las hojas, el parénquima de los
tallos de gramíneas y leguminosas inmaduras, y el floema de las gramíneas inmaduras, se
degradan rápidamente (1), en algunos casos en menos de 12 horas de incubación (18),
otros tejidos vegetales presentan resistencia a la degradación. Los residuos de
degradación microbiana de hojas incluyen una elevada proporción de esclerénquima y
xilema, y los de tallos de xilema, en caso de las leguminosas, y de epidermis,
esclerénquima y xilema en gramíneas (1). Como indican Akin y Rigsby (4), el mesófilo es
rápidamente degradado por las bacterias ruminales sin precisar adhesión, mediante una
acción enzimática extracelular, mientras que la epidermis y las vainas de los paquetes
parenquimatosos precisan una íntima adhesión de las principales especies fibrolíticas.
La resistencia de estos tejidos a su degradación se debe tanto a su estructura anatómica
como a su composición química.
La lignificación de la planta es uno de los factores que más afecta a
la degradación micro biana de los forrajes, tanto por su indigestibilidad per se como en cuanto a su relación con las cadenas de hemicelulosas. El carácter hidrofóbico
de la lignina acentúa el proceso de deshidratación de la pared celular a medida que
aumenta la edad de la planta, lo que disminuye la accesibilidad de los polisacáridos
estructurales. Además, una considerable proporción de las unidades de arabinosa de las
cadenas laterales de xilanos están esterificadas con ácidos p-cumárico y ferúlico [en
paja de cebada, 2,9 y 6,7 %, respectivamente (58)], que establecen enlaces con las cadenas
de lignina. Aunque estos compuestos fenólicos, especialmente el ácido p-cumárico, son
tóxicos para la población microbiana ruminal (46), su concentración en el contenido
rumen es probablemente insuficiente para generar este efecto (17). No obstante, su
solubilización a partir de las paredes celulares pudiera provocar en las zonas de activa
degradación una concentración de fenoles próxima a los niveles tóxicos, por lo que
pueden inhibir, o al menos ralentizar, la actividad fibrolítica bacteriana (28).
Cuadro 5. Utilización de carbohidratos por bacterias ruminales
celulolíticas y no celulolíticas (69).
Especies bacterianas |
Polisacáridos |
Mono- y disacáridos |
Celulolíticas: |
|
|
Fibrobacter succinogenes |
celulosa, celodextrinas |
G, C |
Ruminococcus flavefaciens |
celulosa, xilano, pectina, celodextrinas |
C |
Ruminococcus albus |
celulosa, xilano, celodextrinas |
G, C, X, A |
Celulolíticas secundarias: |
|
|
Butyrivibrio fibrisolvens |
celulosa, xilano, dextrina, pectina, celodextrinas |
G, Ga, Mn, F, M, X, L, C |
Clostridium longisporum |
celulosa |
G, Ga, F, C, M, L, S |
Clostridium locheadii |
celulosa, dextrina |
G, M, S |
No celulolíticas: |
|
|
Prevotella ruminicola |
pectina, almidón, dextrina, celodextrinas |
G, Ga, F, L, C, X, A, R, M |
Selenomonas ruminantium |
almidón, dextrina, celodextrinas |
G, Ga, F, X, A, C, M, L, S |
Streptococcus bovis |
almidón, celodextrinas |
G, Ga, F, Mn, C, M, L, S |
Succinivibrio dextrinosolvens |
dextrina, pectina |
G, Ga, Mn, X, M, A, F, S |
Abreviaturas: A: arabinosa, C: celobiosa, F: fructosa, G: glucosa, Ga:
galactosa, L: lactosa, M: maltosa, Mn: manosa, R: ramnosa, S: sacarosa y X: xilosa.
Cuadro 6. Nivel (g/kg) de digestión de la pared celular de dos
forrajes y utilización de los productos por diversas cepas de especies bacterianas en
cultivo puro. Gr: gramínea, Bromus inermis; Lg: leguminosa, Medicago sativa. (20).
|
dig. celulosa |
dig. hemicel. |
util. hemicel. |
dig. pectina |
util. pectina |
|
Gr. |
Lg. |
Gr. |
Lg. |
Gr. |
Lg. |
Gr. |
Lg. |
Gr. |
Lg. |
F.succinogenes |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
A3c |
794 |
616 |
540 |
603 |
21 |
51 |
|
|
|
|
S85 |
810 |
642 |
773 |
621 |
30 |
0 |
|
|
|
|
R. flavefaciens |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
B1a |
581 |
252 |
566 |
446 |
230 |
101 |
|
|
|
|
B34b |
563 |
541 |
778 |
563 |
0 |
21 |
713 |
705 |
298 |
304 |
C1a |
488 |
478 |
|
|
0 |
85 |
|
|
|
|
R. albus |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
7 |
573 |
534 |
609 |
501 |
460 |
269 |
|
|
|
|
P. ruminicola |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H8a |
7 |
19 |
47 |
336 |
61 |
339 |
|
|
|
|
23 |
|
|
|
|
|
|
550 |
367 |
526 |
366 |
B. fibrisolvens |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
H10b |
149 |
59 |
519 |
354 |
413 |
341 |
|
|
|
|
D16f |
|
|
|
|
|
|
553 |
675 |
497 |
573 |
L. multiparus |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
D15d |
|
|
22 |
495 |
48 |
232 |
456 |
629 |
432 |
504 |
La capa de cutina que cubre la epidermis es prácticamente impermeable
a la adhesión microbiana (2), excepto para algunos hongos (41), lo que obliga a los
microorganismos a colonizar los tejidos digestibles a través de estomas o a partir de
cortes y secciones libres de esa cutícula, en gran medida provocados durante la
masticación (51), en un proceso de dentro a afuera (16). Puede contener hasta 18
ó 24 % de sílice integrado en ella, que le confiere una mayor resistencia a la ruptura y
a su digestión (36). Su proporción puede aumentar bajo condiciones de alta temperatura,
luz y aridez (73). La epidermis está débilmente adherida al mesófilo en las hojas de
leguminosas y de muchas gramíneas C3, pero firmemente fijada a los haces vasculares en
las C4, por lo que puede entorpecer el proceso de digestión (85). Por lo demás, la
epidermis libre de esta cutícula, es degradada en menos de 8 horas en el rumen (18).
El xilema y el esclerénquima de las hojas de las gramíneas, por su
densidad, supone una barrera a la colonización y a la acción de las enzimas microbianas,
tanto sobre estos tejidos como sobre otros que pueden quedar físicamente protegidos (74).
No obstante, el esclerénquima de las hojas, aunque lignificado, no es totalmente
inaccesible a la colonización microbiana, sino que puede observarse cierta degradación
en sus zonas periféricas (1). Las hifas de los hongos tienen capacidad para perforar los
tejidos vegetales más lignificados, con lo que favorecen el acceso bacteriano a los
tejidos internos (6). La proporción de xilema y esclerénquima es similar en gramíneas
C3 y C4. Sin embargo, una mayor proporción de epidermis y vainas de paquetes
parenquimatosos en las C4, en mayor proporción en condiciones adversas de crecimiento
(37), suponen una barrera adicional al ataque microbiano. Además, la estructura radial y
compacta del mesófilo en las hojas de gramíneas tropicales (35) ralentiza la
degradación. No existen diferencias específicas entre las hojas de leguminosas de origen
tropical o templado; aunque son en general muy digestibles, los taninos presentes en
algunas especies puede retrasar la digestión del mesófilo (1).
Los tallos, tanto de leguminosas como de gramíneas C3 y C4, presentan
una estructura rígida, en la que la epidermis, esclerénquima y tejido vascular están
muy lignificados y son prácticamente indigestibles (1). El parénquima se lignifica con
la madurez de la planta, disminuyendo su digestibilidad (73). Las diferencias en las
proporciones de tejidos entre las distintas gramíneas no son aparentes en el caso de los
tallos, por lo que son las condiciones de cultivo las que determinan diferencias en su
digestibilidad (5). No parece que el parénquima de los tallos de leguminosas se
lignifique conforme avanza la madurez de la planta (1), lo que garantiza una mayor
degradación de los tallos de especies leguminosas respecto a los de gramíneas.
Condiciones del ambiente ruminal. Las condiciones ambientales en
las que se desarrolla el proceso de degradación de la pared celular, tanto las
características físicas y químicas del medio como las interacciones entre distintos
microorganismos, determinan el grado y ritmo de digestión de los forrajes. Algunos de
estos aspectos y su repercusión son tratados en esta Reunión por otros autores.
Las bacterias fibrolíticas requieren amoníaco, ácidos grasos
ramificados, vitaminas y minerales para su crecimiento y óptima actividad fibrolítica
(21, 64). El fluido ruminal contiene estos nutrientes en cantidad suficiente para
garantizar la satisfacción de las necesidades, aunque dietas a base de forrajes de baja
calidad pueden ser deficitarias en algunos minerales (P, S, Mg), o provocar una baja
concentración de amoníaco en el rumen, por lo que dicha actividad podría verse
restringida (24).
Aunque niveles bajos de suplementación en dietas forrajeras pueden
tener un efecto positivo sobre la digestión de fibra, al inducir un aumento de la
concentración de organismos (23), la incorporación en la dieta de altas proporciones de
carbohidratos como suplemento energético repercute en un descenso de la digestión
microbiana de la fibra. La acidificación del medio debida al acceso inmediato a una
fuente de energía rápidamente utilizable, aumentando las concentraciones de lactato y
ácidos grasos volátiles hasta sobrepasar la capacidad absortiva del rumen, es el
principal factor implicado (40). El descenso de pH hasta niveles críticos para la
población fibrolítica [< 5,9; (63)] afecta a la actividad polisacaridasa microbiana
(43), aunque parece que no a su capacidad de adhesión (62).
Hiltner y Dehority (40) y Huhtanen y Khalili (43) no observan un efecto
negativo de la suplementación cuando el medio se mantiene a pH tamponado, pero algunos
autores (57, 61) han sugerido que, independientemente del descenso de pH, una mayor
afinidad por substratos más accesibles puede retrasar tanto la adhesión a partículas
menos digestibles, por preferencia de substrato, como la síntesis de enzimas
celulolíticas, por un mecanismo de retroinhibición debido a la concentración de
monosacáridos en el medio. Este efecto independiente del pH se ha descrito en hongos (56)
y en F. succinogenes (42, 62), pero no en bacterias del género Ruminococcus (62).
La magnitud de las respuesta depende de las características del
substrato, así como de las del carbohidrato suplementado. En experimentos llevados a cabo
en nuestro laboratorio (7, 8), la adhesión microbiana in vitro a pared celular
extraída de paja de cebada aumenta por la suplementación (35 % del sustrato total)
respecto a un medio no suplementado, debido a la compensación del escaso nivel de
nutrientes de este medio basal (figura 2). La magnitud de esta respuesta positiva al
suplemento es menor con paja tratada con amoníaco como substrato (sin publicar). Por otra
parte, con descensos similares del pH del medio (hasta 6,3), la inclusión de pectina
promueve un más rápido acceso a la pared celular de paja que la adición de almidón o
una mezcla de azúcares solubles, lo que repercute en una mayor desaparición de los
componentes de los polisacáridos estructurales del substrato (7). Dado que no hay
diferencias entre suplementos en la actividad enzimática que indiquen una
retroinhibición enzimática debida a la concentración de monosacáridos en el medio, y
ya que las bacterias celulolíticas no emplean los productos de su hidrólisis como
nutrientes, la pectina puede ejercer una acción física de barrera que favorece la
digestión, a diferencia de los otros carbohidratos a estudio.
Implicaciones
Las diferentes características, tanto químicas como anatómicas, de
los forrajes empleados en la alimentación de los rumiantes, determina el grado de
adhesión microbiana y de acción enzimática sobre la pared celular vegetal, y con ello
el nivel de digestión de dichos forrajes. Diversas especies de hongos, bacterias y
protozoos están implicadas en esos procesos, tanto directa como indirectamente, lo que
muestra la necesidad de abordar el ecosistema ruminal globalmente para comprender su
actividad, con vistas a optimizar la utilización de los forrajes para el ganado rumiante,
así como para establecer las estrategias de alimentación y de manipulación del ambiente
que contribuyan a conseguir este objetivo.
Literatura citada
1. Akin, D. E., 1989. Histological and physical factors affecting
digestibility of forages. Agron. J., 81:17-25.
2. Akin, D. E. y R. Benner. 1988. Degradation of polysaccharides and
lignin by ruminal bacteria and fungi. Appl. Environ. Microbiol., 54: 1117-1125.
3. Akin, D. E. y L. L. Rigsby. 1985. Influence of phenolic acids on
rumen fungi. Agron. J. 77: 180-182.
4. Akin, D. E. y L. L. Rigsby. 1985. Degradation of Bermuda and
orchardgrass by species of ruminal bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 50:825-830.
5. Akin D. E., R. H. Brown y L. L. Rigsby. 1984. Digestion of stem
tissues in Panicum species. Crop Sci., 24: 769-773.
6. Akin, D. E., C. E. Lyon, W. R. Windham y L. L. Rigsby. 1989.
Physical degradation of lignified stem tissues by ruminal fungi. Appl. Environ.
Microbiol., 55: 611-616.
7. Barrios Urdaneta, A., M. Fondevila, J. M. Peiró and C. Castrillo.
1996. Effect of the source of carbohydrate supplemented on bacterial adhesion and
digestion of straw cell wall. Ann. Zootech., 45:295.
8. Barrios Urdaneta, A., M. Fondevila, S. M. Martín-Orúe and J. C.
Machado Nogueira. 1997. Microbial growth and polysaccharidase activity against straw cell
wall in response to the nature of added carbohydrates. Reprod., Nutr. Dev., (en prensa).
9. Bauchop, T. 1989. Colonization of plant fragments by protozoa and
fungi. En: J.V. Nolan, R.A. Leng, D.I. Demeyer (Eds.). The roles of protozoa and fungi in
ruminant digestion. Penanbul Books, Armidale. pp.83-96.
10. Bayer, E. A., R. Kenig and R. Lamed. 1983. Adherence of Clostridium
thermocellum to cellulose. J. Bacteriol., 156: 818-827.
11. Bernalier, A., G. Fonty, F. Bonnemoy and P. Gouet. 1992.
Degradation and fermentation of cellulose by the rumen anaerobic fungi in axenic cultures
or in association with cellulolytic bacteria. Curr. Microbiol., 25: 143-148.
12. Bohatier, J., J. Sénaud and M. Benyahya. 1990. In situ degradation
of cellulose fibres by the entodiniomorph rumen ciliate Polyplastron multivesiculatum.
Protoplasma, 154: 122-131.
13. Bonhomme, A., G. Fonty, M. J. Foglietti, D. Robic and M. Weber.
1986. Endo-1,4-ß glucanasa y ß glucosidasa del ciliado Polyplastron multivesiculatum free of cellulolytic bacteria. Can. J. Microbiol., 32: 219-225.
14. Borneman, W. S. and D. E. Akin. 1990. Lignocellulose degradation by
rumen fungi and bacteria: ultrastructure and cell wall degrading enzymes. En: D. E. Akin,
L. G. Ljungdahl, J. R. Wilson y P. J. Harris (Eds.). Microbial and plant opportunities to
improve lignocellulose utilization by ruminants. Elsevier, Nueva York. pp. 325-339.
15. Borneman, W. S., L. G. Ljungdahl, R. D. Hartley and D. E Akin.
1991. Isolation and characterization of p-coumaryl esterase from the anaerobic fungus Neocallimastix
frontalis strain MC2. Appl. Environ. Microbiol. 57: 2337-2344.
16. Cheng, K. J., C. W. Forsberg, H. Minato and J. W. Costerton. 1991.
Microbial ecology and physiology of feed degradation within the rumen. En: T. Tsuda, Y.
Sasaki, R. Kawashima (Eds.). Physiological aspects of digestion and metabolism in
ruminants. Academic Press, San Diego. pp. 595-624.
17. Chesson, A. and C. W. Forsberg. 1988. Polysaccharide degradation by
rumen microorganisms. En: P. N. Hobson (Ed.). The rumen microbial ecosystem. Elsevier
Applied Science, Nueva York. pp.251-284.
18. Chesson, A., C. S. Stewart, K. Dalgarno and T. P. King. 1986.
Degradation of isolated grass mesophyl, epidermis and fibre cell walls in the rumen and by
cellulolytic rumen bacteria in axenic culture. J. Appl. Bacteriol., 60: 327-336.
19. Czerkawski, J. W. and K. J. Cheng. 1988. Compartimentation in the
rumen. p. 361-385. En: P. N. Hobson (Ed.). The rumen microbial ecosystem . Elsevier
Applied Science, Nueva York.
20. Dehority, B. A. 1993. Microbial ecology of cell wall fermentation.
En: H. G. Jung, D. R. Buxton, R. D. Hatfield y J. Ralph (Eds.). Forage cell wall structure
and digestibility . ASA-CSSA-SSSA, Madison. pp. 425-453.
21. Dehority, B. A. and Scott, H. W., 1967. Extent of cellulose and
hemicellulose digestion in various forages by pure cultures of rumen bacteria. J. Dairy
Sci., 50: 1136-1141.
22. Dehority, B. A., Scott, H. W. and P. Kowaluk. 1967. Volatile fatty
acid requirements of cellulolytic rumen bacteria. J. Bacteriol., 94: 537-543.
23. Demeyer, D. I. 1981. Rumen microbes and digestion of plant cell
walls. Agric. Environ., 6: 295-337.
24. Durand, M., 1989. Conditions for optimizing cellulolytic activity
in the rumen. p. 3-18. En: M. Chenost y P. Reiniger (Eds.). Evaluation of straws in
ruminant feeding. Elsevier Applied Science, Barking.
25. Flint, H. J., 1994. Degradation of plant cell wall polysaccharides
by rumen bacteria. pp. 49-67. En: R. A. Prins y C. S. Stewart (Eds.). Microorganisms in
ruminant nutrition. Nottingham University Press, Nottingham.
26. Flint, H. J. y C.W. Forsberg. 1995. Polysaccharide degradation in
the rumen: biochemistry and genetics. pp. 43-70. En: Ruminant physiology: digestion,
metabolism, growth and reproduction . W.v. Engelhardt, S. Leonhardt-Marek, G.Breves y D.
Gieseke (eds.).Enke Verlag, Stutgart.
27. Fondevila, M. and Dehority, B.A., 1994. Degradation and utilization
of forage hemicellulose by rumen bacteria, singly, in coculture or added sequentially. J.
Appl. Bacteriol., 77: 541-548.
28. Fondevila, M., G. Muñoz, C. Castrillo, F. Vicente and S. M.
Martín-Orúe. 1997. Differences in microbial fermentation of barley straw induced by its
treatment with anhydrous ammonia. Anim. Sci., 65 (en prensa).
29. Fonty, G and K. N. Joblin. 1991. Rumen anaerobic fungi: their role
and interactions with other rumen microorganisms in relation to fiber digestion. pp.
655-679. In: Physiological aspects of digestion and metabolism in ruminants. T. Tsuda, Y.
Sasaki, R. Kawashima (eds.). Academic Press, San Diego.
30. Fonty, G., A. . Williams, F. Bonnemoy, B. Morvan, J. Doré and P.
Gouet, P. 1992. Interactions between cellulolytic bacteria, anaerobic fungi and
methanogens in the rumen of gnotobiotic lambs. p. 338-342. Proc. Int. Conf. on
«Manipulation of rumen microorganisms to improve efficiency of fermentation and ruminant
nutrition» . Alejandría, Egipto. 20-23 Septiembre.
31. Forsberg, C.W. y K. Lam. 1977. Use of adenosine-5'-triphosphate as
an indicator of the microbiota biomass in rumen contents. Appl. Environ. Microbiol., 33:
528-537.
32. Gilbert, H.J., J. Hall, G. P. Hazelwood y L. M. A. Ferreira. 1990.
The N-terminal region of an endoglucanase from Pseudomonas fluorescens subspecies
cellulosa constitutes a cellulose-binding domain that is distinct from the catalytic
centre. Mol. Microbiol., 4: 759-767.
33. Gong, J. and C. W. Forsberg. 1989. Factors affecting adhesion of
Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes S85 and adherence-defective mutants to
cellulose. Appl. Environ. Microbiol., 55: 3039-3044.
34. Grenet, E., A. Breton, P. Barry and P. Fonty. 1989. Rumen anaerobic
fungi and plant substrates colonization as affected by diet composition. Anim. Feed
Sci.Technol., 26: 55-70.
35. Hanna, W.W., W. G. Monson and G. W. Burton. 1973. Histological
examination of fresh forage leaves after in vitro digestion. Crop Sci. 13:
98-102.
36. Harbers, L.H., D. Raiten and G. M. Paulsen. 1981. The role of plant
epidermal silica as a structural inhibitor of rumen microbial digestion in steers. Nutr.
Rep. Int., 24: 1057-1066.
37. Hastert, A.A., C. E. Owensby and L. H. Harbers. 1983. Rumen
microbial degradation of indiangrass and big bluestem leaf blades. J. Anim. Sci., 57:
1626-1636.
38. Hatfield, R. 1990. Physiological changes and metabolic events that
reduce lignocellulosic utilization. En: Microbial and plant opportunities to improve
lignocellulose utilization by ruminants . D.E. Akin, L.G. Ljungdahl, J.R. Wilson y P.J.
Harris (eds.). Elsevier, Nueva York. pp. 91-98.
39. Hébraud, M. y M. Fèvre. 1988. Characterization of glycosides and
polysaccharide hydrolases secreted by the rumen anaerobic fungi Neocallimastix
frontalis, Sphaeromonas comunis and Piromyces comunis. J. Gen.
Microbiol. , 134: 1123-1129.
40. Hiltner, P. y B. A. Dehority. 1983. Effect of soluble carbohydrates
on digestion of cellulose by pure cultures of rumen bacteria. Appl. Environ. Microbiol.,
46: 642-648.
41. Ho, Y. W., N. Abdullah y S. Jalaludin. 1988. Penetrating structures
of anaerobic rumen fungi in cattle and swamp buffalo. J. Gen. MIcrobiol., 134: 177-181.
42. Huang, L. y C. W. Forsberg. 1990. Cellulose digestion and cellulase
regulation and distribution in Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes S85. Appl.
Environ. Microbiol., 56: 1221-1228.
43. Huhtanen, P. y H. Khalili. 1992. The effect of sucrose supplements
on particle-associated carboxymethyl-cellulase (EC 3.2.1.4) and xilanase (EC 3.2.1.8)
activities in cattle given grass-silage-based diet. Br. J. Nutr., 67: 245-255.
44. Joblin, K. N. y G. E. Naylor. 1989. Fermentation of woods by rumen
anaerobic fungi. FEMS Microbiology Letters , 65:111-122.
45. Jouany, J. P. y K. Ushida. 1994. Plant cell-wall degradation by
rumen protozoa. En: Microorganisms in ruminant nutrition . R.A. Prins y C.S. Stewart
(eds.), Nottingham University Press, Nottingham. pp. 69-78.
46. Jung, H. G., G. C. Fahey Jr. and N. R. Merchen. 1983. Effects on
ruminant digestion and metabolism of phenolic monomers of forages. Br. J. Nutr., 50:
637-651.
47. Kudo, H., K. J. Cheng and J. W. Costerton. 1987. Electron
microscopic study of the methylcellulose-mediated detachment of cellulolytic rumen
bacteria from cellulose fibers. Can. J. MIcrobiol., 33: 267-272.
48. Lamed, R., E. Setter, R. Kenig and E. A. Bayer. 1983. The
cellulosome. A discrete cell surface organelle of Clostridium thermocellum which
exhibits separate antigenic cellulose-binding and various cellulolytic activities.
Biotech. Bioeng. Symp. , 13: 163-181.
49. Latham, M. J., B. E. Brooker, G. L. Pettipher and P. J. Harris.
1978. Ruminococcus flavefaciens cell coat and adhesion to cotton cellulose and to
cell walls in leaves of perennial ryegrass (Lolium perenne). Appl. Environ.
Microbiol. , 35: 156-165.
50. Mayer, F., M. P. Coughlan, Y. Mori and L. G. Ljungdahl. 1987.
Macromolecular organization of the cellulolytic enzyme complex of Clostridium thermocellum
as revealed by electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol., 53: 2785-2792.
51. McAllister, T. A., H. D. Bae, G. A. Jones, and K. J. Cheng. 1994.
Microbial attachment and feed digestion in the rumen. J. Anim. Sci. , 72: 3004-3018.
52. McGavin, M. and C. S. Forsberg. 1989. Catalytic and
substrate-binding domains of endoglucanase 2 from Bacteroides succinogenes. J. Bacteriol.
, 171: 3310-3315.
53. Minato, H. and T. Suto. 1978. Technique for fractionation of
bacteria in rumen mirobial ecosystem. II. Attachment of bacteria isolated from bovine
rumen to cellulose powder in vitro and elution of bacteria attached therefrom. J. Gen.
Appl. Microbiol. , 24: 1-16.
54. Miron, J., M. T. Yokoyama and R. Lamed. 1989. Bacterial cell
surfaces structures involved in lucerne cell wall degradation by pure cultures of
cellulolytic rumen bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 32: 218 -222.
55. Morris, E.J. and O. J. Cole. 1987. Relationship between
cellulolytic activity and and adhesion to cellulose in Ruminococcus albus . J. Gen.
Microbiol., 13: 1023-1032.
56. Morrison, M., R. J. Mackie and A. Kistner. 1990. Evidence that
cellulolysis by an anaerobic ruminal fungus is catabolite regulated by glucose, cellobiose
and soluble starch. Appl. Environ. Microbiol., 56: 3227-3229.
57. Mould, F.L., E. R. Ørskov and S. O. Mann. 1983. Associative
effects of mixed feeds. 1. Effect of type and level of supplementation and the influence
of the rumen fluid pH on cellulolysis in vivo and dry matter digestion of various
roughages. Anim. Feed Sci. Technol., 10: 15-30.
58. Mueller-Harvey, I. and R. D. Hartley. 1986. Linkage of p-coumaroyl
and feruloyl groups to cell wall polysaccharides of barley straw. Carbohydr. Res., 148:
71-85.
59. Orpin, C. G. 1983. The role of ciliate protozoa and fungi in the
rumen digestion of plant cell walls. Anim. Feed Sci. Technol., 10:121-143.
60. Pell, A. and P. Schofield. 1993. Microbial adhesion and degradation
of plant cell walls. En: Forage cell wall structure and digestibility . H.G. Jung, D.R.
Buxton, R.D. Hatfield y J. Ralph (eds.). ASA-CSSA-SSSA, Madison. pp. 397-423.
61. Piwonka, E.J. and J. L. Firkins. 1993. Effect of glucose on fiber
digestion and particle-associated carboxymethyl-cellulase activity in vitro.J. Dairy Sci.,
76: 129-139.
62. Roger, V., G. Fonty, S. Komisarczuk-Bony and P. Gouet. 1990.
Effects of physicochemical factors on the adhesion to cellulose avicel of the ruminant
bacteria Ruminococcus flavefaciens and Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes. Appl.
Environ. Microbiol., 56: 3081-3087.
63. Russell, J. B. and D. B. Wilson. 1996. Why are ruminal cellulolytic
bacteria unable to digest cellulose at low pH? J. Dairy Sci., 79: 1503-1509.
64. Scott, H.W. and B. A. Dehority. 1965. Vitamin requirements of
several cellulolytic rumen bacteria. J. Bacteriol., 89: 1169-1175.
65. Stack, R.J. and R. E. Hungate. 1984. Effect of 3-phenilpropanoic
acid on capsule and cellulases of Ruminococcus albus 8. Appl. Environ. Microbiol. ,
48:218-223.
66. Stewart, C. S. 1994. Plant-animal and microbial interactions in
ruminant fibre degradation. p. 13-28. En: Microorganisms in ruminant nutrition. R.A. Prins
y C.S. Stewart (eds.), Notting-ham University Press, Nottingham.
67. Stewart, C. S. y H. J. Flint. 1989. Bacteroides (Fibrobacter) succinogenes , a cellulolytic anaerobic bacterium from the gastrointestinal tract.
Appl. Microbiol. Biotechnol., 30: 433.
68. Varel, V. H., J. T. Yen and K. K. Kreikmeier. 1995. Addition of
cellulolytic clostridia to the bovine rumen and pig intestinal tract. Appl. Environ.
Microbiol., 61: 1116.
69. Weimer, P. J. 1996. Why don't ruminal bacteria digest cellulose
faster?. J. Dairy Sci., 79: 1496 - 1502.
70. White, B.A., R. I. Mackie, and K. C. Doerner. 1993. Enzymatic
hydrolisis of forage cell wall. pp. 455-498. En: Forage cell wall structure and
digestibility. H.G. Jung, D.R. Buxton, R.D. Hatfield y J. Ralph (eds.). ASA-CSSA-SSSA,
Madison.
71. Williams, A. G. and G. S. Coleman. 1988. The rumen protozoa. p.
77-128. En: The rumen microbial ecosystem. P.N. Hobson (ed.), Elsevier Applied Sciences,
Londres.
72. Williams, A. G., S. E. Withers and G. S. Coleman. 1984. Glycoside
hydrolases of rumen bacteria and protozoa. Curr. Microbiol. 10: 287-294.
73. Wilson, J. R.,1990. Influence of plant anatomy on digestion and
fibre breakdown. pp. 99-117. En: Microbial and plant opportunities to improve
lignocellulose utilization by ruminants . D. E. Akin, L. G. Ljungdahl, J.R. Wilson y P.J.
Harris (eds.). Elsevier, Nueva York.
74. Wilson, J. R. y D. R. Mertens. 1995. Cell wall accesibility and
cell structure limitations to microbial digestion of forage. Crop Sci. 35: 251.
75. Wilson, J. R., M. N. McLeod and D. J. Minson. 1989. Particle size
reduction of leaves of a tropical and a temperate grass by cattle. I. Effect of chewing
during eating at varying times of digestion. Grass For. Sci., 44: 55-63. |